Title	Characterization of PmSpatzle and SPIPm5 from black tiger shrimp Penaeus monodon / Sittichai Boonrawd = ลักษณะสมบัติของ PmSpatzle และ SPIPm5 จากกุ้งกุลาดำ Penaeus monodon / สิทธิชัย บุญรอด
Imprint	2018
Connect to	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/61499
Descript	xv, 119 pages : illustrations, charts

Humoral response proteins in shrimp, antimicrobial proteins (AMPs) and proteinase inhibitors, are implicated in host defenses against the pathogen infection because their expression is changed in response to microbial infection. After the pathogen infection in shrimp, the Spätzle protein is synthesized and activated the pathogenic signaling via Toll pathway by its active protein for the synthesis of AMPs. In this study, three PmSpätzle isoforms, PmSpz1, 2 and 3 genes, were identified in Penaeus monodon. The PmSpz1 gene was chosen for studied in details. Its gene was expressed in all shrimp tissues tested and in response to WSSV infection. Western blot analysis of hemolymph showed that the PmSpz1 mostly existed as an active form awaiting to activate Toll pathway. Injection of a recombinant PmSpz1 rendered the shrimp less susceptible to the WSSV challenge. The recombinant of active Spätzle activated the synthesis of AMP genes: crustinPm1, crustinPm7, ALFPm3, penaeidin3 but not penaeidin5. It is indicating that the expression of all antimicrobial proteins but not penaeidin5 was expressed under the regulation of Toll pathway. For SPIPm5 protein, the Kazal-type serine proteinase inhibitor from P. monodon was also studied. Its transcripts were also expressed in all tissues tested and its gene expression was up-regulated by heat stress, WSSV and YHV. Injection of rSPIPm5 into shrimp to mimic heat stress condition had more or less no effect on the crustinPm1, penaeidin3, penaeidin5, Hsp70, SPIPm2 and SPIPm5. The effect of rSPIPm5 protein inhibited the hemolymph proPO activity. In survival experiments, the rSPIPm5 could also prolong the shrimp from pathogen infection, WSSV, YHV, Vibrio harveyi and Vibrio parahaemolyticus in shrimp. The increased endurance against the microbial infection was due to the inhibitory effects presumably activated by rSPIPm5 on viral replication and bacterial growth but not the expression of AMPs gene. The microbial inhibitory effects may be activated by rSPIPm5. Therefore, the SPIPm5 plays an important role in shrimp innate immunity against the viral and bacterial infection besides its function as a proteinase inhibitor
โปรตีนจากระบบภูมิคุ้มกันในน้ำเลือดของกุ้ง ได้แก่ เพปไทด์ต้านจุลชีพ และตัวยับยั้งซีรีนโพรทีเนส พบว่ามีส่วนเกี่ยวข้องในการต้านทานต่อการเข้าทำลายของเชื้อโรค หลังจากการเข้าทำลายของเชื้อโรคในกุ้ง โปรตีน Spätzle ก็ถูกสังเคราะห์ขึ้น และกระตุ้นสัญญาณการตอบสนองต่อการเข้าทำลายของเชื้อผ่านวิถี Toll ด้วยโปรตีน active Spätzle เพื่อที่จะสังเคราะห์เพปไทด์ต้านจุลชีพ  ในงานวิจัยนี้ยีน PmSpätzle ทั้ง 3 ไอโซฟอร์ม ถูกพบในกุ้งกุลาดำ P. monodon ได้แก่ ยีน PmSpz1, 2 และ 3 โดยเลือกยีน PmSpz1 เพื่อศึกษาหน้าที่ โดยจากการทดลองพบการแสดงออกของยีน PmSpz1 ในทุกเนื้อเยื่อทดสอบ และมีการตอบสนองต่อการเข้าทำลายของเชื้อไวรัสตัวแดงดวงขาว (WSSV) การวิเคราะห์โปรตีน PmSpz1 ในน้ำเลือดด้วยเทคนิค Western blot analysis พบว่าโปรตีน PmSpz1 ส่วนใหญ่จะอยู่ในรูป active PmSpz1 ซึ่งรอที่จะกระตุ้นผ่านวิถี Toll การฉีดรีคอมบิแนนท์โปรตีน PmSpz1 ทำให้กุ้งไม่อ่อนแอต่อการเข้าทำลายของไวรัสตัวแดงดวงขาว สำหรับการฉีดด้วยรีคอมบิแนท์โปรตีน active PmSpz1 ได้กระตุ้นการแสดงออกของยีน crustinPm1, crustinPm7, ALFPm3, penaeidin3 แต่ไม่พบการแสดงออกยีน penaeidin5 เพิ่มขึ้น  จากงานวิจัยนี้แสดงให้เห็นว่า การแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของยีนเพปไทด์ต้านจุลชีพดังกล่าว ยกเว้นยีน penaeidin5 อยู่ภายใต้การควบคุมของวิถี Toll  สำหรับโปรตีน SPIPm5 ได้มีการศึกษาโปรตีนยับยั้งซีรีนโพรทีเนสชนิดคาซาลจากกุ้งกุลาดำ P. monodon โดยตรวจพบการแสดงออกของยีน SPIPm5 ในทุกเนื้อเยื่อทดสอบ และมีการแสดงออกของยีน SPIPm5 ที่เพิ่มขึ้นภายใต้ภาวะความเครียดจากความร้อน การเข้าทำลายของไวรัสตัวแดงดวงขาว (WSSV) และไวรัสหัวเหลือง (YHV) จากนั้นทำการฉีดรีคอมบิแนนท์โปรตีน SPIPm5 เข้าไปในกุ้ง ซึ่งเป็นการเลียนแบบ การแสดงออกของยีน SPIPm5 ที่เพิ่มขึ้น เช่นเดียวกับกุ้งที่อยู่ในภาวะความเครียดจากความร้อน พบว่ามีการแสดงออกของยีนทั้งที่เพิ่มขึ้น สำหรับยีน crustinPm1 และ penaeidin5 นอกจากนี้ยังพบว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลงต่อการแสดงออกของยีน penaeidin3, hsp70, SPIPm2 และ SPIPm5  สำหรับรีคอมบิแนนท์โปรตีน SPIPm5 ในน้ำเลือดของกุ้ง สามารถยับยั้งระบบโพรฟีนอลออกซิเดส  ในการทดลองเพื่อศึกษาอัตราการรอดของกุ้ง พบว่ารีคอมบิแนนท์โปรตีน SPIPm5 สามารถทำให้กุ้งมีอัตราการรอดที่เพิ่มขึ้นจากการเข้าทำลายของเชื้อไวรัสตัวแดงดวงขาว, ไวรัสหัวเหลือง, แบคทีเรีย Vibrio harveyi และ Vibrio parahaemolyticus การต้านทานที่เพิ่มขึ้นต่อการเข้าทำลายของเชื้อโรคนั้นสัณนิษฐานว่าเกิดจากการถูกกระตุ้นด้วยรีคอมบิแนนท์โปรตีน SPIPm5 มีผลต่อการลดจำนวนทั้งในไวรัสตัวแดงดวงขาว, ไวรัสหัวเหลือง และการเจริญของเชื้อแบคทีเรีย V. harveyi และ V. parahaemolyticus แต่ไม่มีผลต่อการแสดงออกของยีนเพปไทด์ต้านจุลชีพ ซึ่งผลของการเข้าทำลายเชื้อโรคอาจถูกต้านทานด้วยรีคอมบิแนนท์โปรตีน SPIPm5 ดังนั้นโปรตีน SPIPm5 จึงมีบทบาทสำคัญต่อระบบภูมิคุ้มกันในกุ้งในการต้านทานต่อการเข้าทำลายของไวรัส และแบคทีเรียด้วย นอกเหนือจากทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้งซีรีนโพรทีเนส