Title	Expression and characterization of alpha glucosidase from Weissella Confusa BBK 1 / Lalita Silapasom = การแสดงออกและลักษณะสมบัติของแอลฟากลูโคซิเดสจาก Weissella confusa BBK-1 / ลลิตา ศิลปสม
Imprint	2017
Connect to	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/61520
Descript	-

Alpha-glucosidase [EC 3.2.1.20; α-D-glucoside glucohydrolase] is an exohydrolase which catalyzes non-reducing end of substrates to release D-glucose. In addition, alpha-glucosidase also displays a transferase activity, which bring about the formation of α-glucosylated compounds such as soluble starch and glycogen. This research aims to express and characterize α-glucosidase from Weissella confusa BBK-1 (WcAG). WcAG gene was expressed in modified pET28b vector. This gene contained an open reading frame of 1,775 bps. Optimum expression condition of WcAG was cultured in LB medium containing 1% (w/v) glucose and induced with 0.4 mM IPTG at 20°C for 20 h. The recombinant WcAG containing his-tag at the C-terminus was successfully purified by His-Trap column with the specific activity of 45.29 U/ml, purification fold of 2.93 increased with 21.65% yields of total activity. WcAG had molecular mass of 124 kDa and existed as dimer in native form. For hydrolysis activity, the optimum temperature and pH were at 50 ºC and pH 6.0, respectively. Temperature and pH stability of WcAG were in range of 4 to 40 °C, and pH 6.0-8.0 in phosphate buffer, respectively. The most suitable substrate for hydrolysis activity of WcAG was maltotriose (G3) while maltose (G2) was for transglycosylation activity. For hydrolysis activity, the order of preferable substrate was maltotriose (G3), maltotetraose (G4), maltopentaose (G5), maltohexaose (G6) and maltose (G2), respectively. For kinetic study of WcAG, the apparent Km, kcat and kcat/ Km values for G3 substrate were 2.67 mM, 14.096 s-1 and 5.279 (s·mM)-1, respectively. The apparent Km, kcat and kcat/ Km values for G2 substrate were 16.22 mM, 0.738 s-1 and 0.046 (s·mM)-1, respectively. The optimal maltooligosacharide production was obtained of incubation using 200 mM of G2 with 0.4 unit/ml of WcAG at 37 ºC for 24 h. Four products were obtained from transglycosylation activity including product I, II, III and IV. Identification of all products using HPAEC-PAD revealed that product I was isomaltose, product II was panose while product III and IV still cannot be identified
แอลฟากลูโคซิเดส [EC 3.2.1.20] คือ  เอนไซม์ที่ตัดจากด้านปลายเข้ามาทีละหน่วย  ซึ่งเร่งปฏิกิริยา การสลายพันธะจากปลายด้านนอนรีดิวซ์ซิงค์ของสารตั้งต้นให้ผลิตภัณฑ์คือกลูโคส นอกจากนี้แอลฟากลูโคซิเดส ยังมีความสามารถในการโยกย้ายหมู่ฟังก์ชั่นทำให้เกิดการสร้างผลิตภัณฑ์ที่หลากหลายจำพวกสารประกอบที่มีกลูโคสเป็นองค์ประกอบ เช่น แป้งและไกลโคเจน  งานวิจัยนี้มีจุดมุ่งหมายในการแสดงออกและศึกษาลักษณะสมบัติของแอลฟากลูโคซิเดสจาก Weissella confusa BBK-1 (WcAG)   ยีน WcAG แสดงออกใน modified pET28b โดยยีนมีขนาด 1775 คู่เบส ภาวะที่เหมาะสมในการแสดงออกของ WcAG คือเลี้ยงเซลล์ในอาหารเหลว (LB broth) ที่มีกลูโคสความเข้มข้นร้อยละ 1 และเหนี่ยวนำด้วย IPTG ความเข้มข้น 0.4 มิลลิโมลาร์ ณ อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 ชั่วโมง  รีคอมบิแนนท์ WcAG ที่มี his-tag ด้านปลาย C ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้คอลัมน์ His-Trap ได้ค่าแอกทิวิตีจำเพาะเท่ากับ 45.29 ยูนิตต่อมิลลิกรัมโปรตีน มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 2.93 เท่าและมีแอกทิวิตีคงเหลือทั้งหมดร้อยละ 21.65 WcAG มีมวลโมเลกุลประมาณ 124 กิโลดาลตันประกอบด้วยโปรตีน 2 หน่วยย่อย  สำหรับปฏิกิริยาไฮโดรไลซิสอุณหภูมิและค่า pH ที่เหมาะสมในการเร่งปฏิกิริยาคือ 50 องศาเซลเซียสและ pH 6.0 ตามลำดับ  การตรวจสอบเสถียรภาพของ WcAG  พบว่ามีความเสถียรในช่วงอุณหภูมิ 4 - 40 องศาเซลเซียสในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 6.0-8.0  โดยสารตั้งต้นที่ดีที่สุดสำหรับปฏิกิริยาไฮโดรไลซิสคือ มอลโทไตรโอส (G3) และปฏิกิริยาการโยกย้ายหมู่คือมอลโทส (G2) โดยปฏิกิริยาไฮโดรไลซิสมีลำดับความชอบของสารตั้งต้นเรียงจากมากไปน้อยคือ มอลโทไตรโอส (G3) มอลโทเตตระโอส (G4) มอลโทเพนตะโอส (G5) มอลโทเฮกซะโอส (G6) และมอลโทส (G2) จากการศึกษาจลนศาสตร์ของ WcAG เมื่อใช้มอลโทไตรโอสเป็น สารตั้งต้นพบว่าค่า Km, kcatและ kcat/Kmคือ 2.67 มิลลิโมลาร์,14.096 วินาที-1และ5.279 (วินาที·มิลลิโมลาร์)-1ตามลำดับ  ค่า Km, kcatและ kcat/ Km เมื่อใช้มอลโทสเป็นสารตั้งต้นคือ 16.22 มิลลิโมลาร์, 0.738 วินาที-1และ 0.046 (วินาที·มิลลิโมลาร์)-1ตามลำดับ ภาวะที่สังเคราะห์มอลโทออลิโกแซคคาไรด์ได้ผลผลผลิตสูงสุดคือการบ่มปฏิกิริยาโดยใช้มอลโทสความเข้มข้น 200 มิลลิโมลาร์กับ WcAG ความเข้มข้น 0.4 ยูนิตต่อมิลลิมิตร ณ อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง   โดยที่ปฏิกิริยาการโยกย้ายหมู่สามารถสังเคราะห์ผลิตภัณฑ์ได้ 4 ชนิด   การวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์โดยใช้เทคนิค HPAEC-PAD พบว่าผลิตภัณฑ์ที่สังเคราะห์ได้คือ ไอโซมอลโทส พาโนสและมอลโทออลิโกแซคคาไรด์อีกสองชนิดที่ยังไม่สามารถระบุได้