Office of Academic Resources
Chulalongkorn University
Chulalongkorn University

Home / Help

TitleProteomic analysis and characterization of vibrio harveyi responsive proteins in the black tiger shrimp Penaeus monodon / Vorrapon Chaikeeratisak = การวิเคราะห์โปรติโอมและลักษณะสมบัติของโปรตีนที่ตอบสนองต่อ Vibrio harveyi ในกุ้งกุลาดำ Penaeus monodon
Author วรพนธ์ ชัยกีรติศักดิ์
Imprint 2011
Connect tohttp://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/27312
Descript xviii, 115 leaves : ill., charts

SUMMARY

Vibriosis, caused by bacteria from the genus Vibrio, is one of the major diseases in shrimp aquaculture resulting in a high mortality and so economic losses. Here, proteomic analysis of the lymphoid organ of V. harveyi infected Penaeus monodon were performed in order to identify potential proteins responsible for the bacterial infection. A number of bacterial responsive proteins regarding antibacterial immunity and/or bacterial infection mechanism were discovered. Among the bacterial responsive proteins obtained from the proteomic screening, ATP synthase beta subunit and alpha-2-macroglobulin (A2M) exhibited considerably altered expression levels against V. harveyi infection. Hence, both of them were further characterized for their potentially necessary roles in the shrimp response to bacterial infection. Partial gene knockdown of ATP synthase beta subunit showed a high cumulative mortality of the transcript silenced shrimps and a dramatic decrease of the total circulating hemocyte numbers in the survival shrimps. We speculate that ATP synthase beta subunit is likely to serve vital roles in shrimp defense against the V. harveyi. Otherwise, the yeast two-hybrid system revealed that PmA2M’s receptor binding domain interacted with the carboxyl-terminus of transglutaminase type II, a key enzyme involved in the shrimp clotting system. In accord with this, PmA2M was found to colocalize with coagulation associated proteins on the extracellular blood clots. RNA interference-mediated knockdown of A2M transcript levels impaired the bacterial seizing ability of the shrimp clotting system, resulting in an up to 3.3-fold higher number of V. harveyi that systemically spreaded into the blood circulation at 5 min post-infection before later elimination by the immune system. A characteristic of PmA2M depleted clots in the presence of V. harveyi obviously illustrated fibrinolysis areas surrounding the bacteria. In vitro observation of V. harveyi entrapping normal shrimp clots; nevertheless, disclosed that the bacterial cells were initially immobilized firmly, but later, they can continue to proliferate and escape when the clots were digested by fibrinolytic enzymes. Additionally, V. harveyi secreted enzymes responsible for the clot lysis were further identified. The fibrinolytic activity of bacterial conditioned media was completely inhibited when adding 1,10 phenanthroline and AEBSF as well as the number of motile bacteria entrapped in the clots was significantly diminished when supplemented with AEBSF. This suggests that both metallo-proteases and serine proteases released from the bacteria are required for substantial fibrinolysis.
เชื้อแบคทีเรียวิบริโอฮาวิอาย เป็นเชื้อแบคทีเรียชนิดหนึ่งที่ก่อโรครุนแรงในกุ้งกุลาดำ (Penaeus monodon) และส่งผลกระทบต่อเศรษฐกิจการเพาะเลี้ยงกุ้ง ในงานวิจัยนี้ได้ใช้เทคนิคการศึกษาโปรตีโอมเพื่อระบุโปรตีนในอวัยวะน้ำเหลืองของกุ้งกุลาดำ ที่มีการแสดงออกเปลี่ยนแปลงไปภายหลังการติดเชื้อแบคทีเรียวิบริโอฮาวิอาย ในการระบุหาโปรตีนนี้ มีโปรตีนจำนวนมากที่มีการแสดงออกเพิ่มขึ้นและลดลง แสดงให้เห็นถึงความเกี่ยวข้องกับกลไกการต้านเชื้อแบคทีเรียและระบบภูมิคุ้มกันของกุ้งกุลาดำ โปรตีน ATP synthase beta subunit และ Alpha-2-macroglobulin (A2M) ซึ่งเป็นโปรตีนที่แสดงออกเปลี่ยนแปลงไปอย่างมากภายหลังการติดเชื้อ ได้ถูกนำมาศึกษาต่อ การยับยั้งการแสดงออกของยีน ATP synthase beta subunit โดยใช้เทคนิค RNA interference (RNAi) ส่งผลทำให้กุ้งมีอัตราการตายสะสมสูงขึ้นและแตกต่างจากกลุ่มควบคุมอย่างเด่นชัด โดยในกลุ่มกุ้งที่ถูกลดการแสดงออกของยีน ATP synthase beta subunit มีปริมาณเซลล์เม็ดเลือดลดลงอย่างมาก การทดลองนี้แสดงให้เห็นว่า ATP synthase beta subunit อาจมีความสำคัญในระบบภูมิคุ้มกันของกุ้ง นอกเหนือจากนี้เราได้ใช้เทคนิค Yeast two-hybrid system ในการค้นหาโปรตีนที่ทำงานร่วมกับโปรตีน A2M ในการต่อต้านการติดเชื้อแบคทีเรียวิบริโอฮาวิอาย จากการทดลองพบว่า Receptor binding domain ของโปรตีน A2M สามารถจับกับปลาย Carboxyl ของเอนไซม์ Transglutaminase ชนิดที่ 2 ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการแข็งตัวของเลือดได้ รวมทั้งเรายังตรวจพบการเรียงตัวของโปรตีน A2M ร่วมกับโปรตีน Clottable protein บนลิ่มเลือดอีกด้วย โดยผลการทดลองนี้แสดงให้เห็นถึงความเกี่ยวข้องของโปรตีน A2M ในกระบวนการแข็งตัวของเลือด
เมื่อทดลองลดการแสดงออกของยีน A2M เราพบว่าระบบการแข็งตัวของเลือดสามารถดักจับเชื้อแบคทีเรียวิบริโอฮาวิอายได้ลดลง โดยจำนวนของเชื้อแบคทีเรียในระบบหมุนเวียนเลือดของกุ้งกลุ่มที่ถูกลดการแสดงออกของยีน A2M มีปริมาณสูงกว่ากุ้งกลุ่มควบคุมถึง 3.3 เท่า ภายหลังการฉีดเชื้อ 5 นาที เมื่อใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดส่องกราด ในการสังเกตลิ่มเลือดของกุ้งกลุ่มที่ถูกลดการแสดงออกของยีน A2M ในสภาวะติดเชื้อ พบว่ามีบริเวณย่อยสลายของลิ่มเลือดเกิดขึ้นรอบๆเซลล์ของแบคทีเรียอย่างชัดเจน ผลการทดลองนี้บ่งชี้ว่าโปรตีน A2M ทำหน้าที่สำคัญในระบบการแข็งตัวของเลือดโดยยับยั้งโปรตีเอสที่หลั่งจากเชื้อแบคทีเรีย อย่างไรก็ตามเชื้อแบคทีเรียสามารถย่อยสลายลิ่มเลือดของกุ้งปกติและเชื้อแบคทีเรียจำนวนหนึ่งสามารถหลบหนีได้ภายใน 2 ชั่วโมง ถึงแม้ว่าเชื้อแบคทีเรียจะถูกจับอย่างเหนียวแน่นในระยะเวลาช่วงเริ่มต้นก็ตาม นอกเหนือจากนี้เมื่อศึกษาฤทธิ์ในการยับยั้งการย่อยสลายลิ่มเลือดของ Extracellular products ในน้ำเลี้ยงเชื้อแบคทีเรียวิบริโอฮาวิอาย และความสามารถในการหลบหนีของเชื้อแบคทีเรียจากลิ่มเลือด โดยใช้ตัวยับยั้งการทำงานของโปรตีเอสชนิดต่างๆ พบว่าโปรตีเอสที่เชื้อใช้ย่อยสลายลิ่มเลือดถูกจัดอยู่ในกลุ่ม Metallo protease และ Serine protease


ปริญญาดุษฎีบัณฑิต Penaeus monodon -- Diseases Proteomics -- Analysis Vibrio infections กุ้งกุลาดำ -- โรค โปรตีโอมิกส์ -- การวิเคราะห์ การติดเชื้อวิบริโอ

LOCATIONCALL#STATUS
Science Library : Thesisวพ.2554 / 5900CHECK SHELVES

Chulalinet's Book Delivery Request




Location



Office of Academic Resources, Chulalongkorn University, Phayathai Rd. Pathumwan Bangkok 10330 Thailand

Contact Us

Tel. 0-2218-2929,
0-2218-2927 (Library Service)
0-2218-2903 (Administrative Division)
Fax. 0-2215-3617, 0-2218-2907

Social Network

  line

facebook   instragram