Title	การวิเคราะห์ความหลากหลายของยีนที่สร้างโปรตีนบนผิวเมอร์โรซอยต์ชนิดที่ 1 ของพลาสโมเดียม ฟัลซิปารั่ม ในมิติเวลาและสถานที่ของประเทศไทย / วฒิภรณ์ สายชนะพันธ์ = Spatio-temporal analysis of variation in the merozoite surface protein-1 locus of plasmodium falciparum in Thailand
Author	Wathiporn Saichanapun
Imprint	2554
Connect to	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/28106
Descript	ก-ฏ, 123 แผ่น : ภาพประกอบ

มาลาเรียยังคงเป็นปัญหาที่สำคัญที่ทำให้เกิดการเสียชีวิตของประชากรในกลุ่มประเทศเขตร้อนรวมทั้งประเทศไทย มาตราการในการควบคุมโรคมาลาเรียที่มุ่งเน้นไปยังการควบคุมโรคมาลาเรียในคน ยุงก้นปล่อง และเชื้อมาลาเรียนั้นกลับมีอุปสรรคจากการที่เชื้อดื้อต่อยาต้านมาลาเรียหลายชนิดรวมทั้งยุงก้นปล่องก็ดื้อต่อยาฆ่าแมลงเช่นกัน ดังนั้นมาตราการอันหนึ่งที่น่าสนใจคือการผลิตวัคซีนป้องกันโรคมาลาเรีย ในบรรดาโปรตีนที่เป็นที่น่าสนใจที่จะใช้เป็นองค์ประกอบของวัคซีนต่อเชื้อมาลาเรียระยะที่พบอยู่ในเม็ดเลือดแดงของเชื้อพลาสโมเดียมฟาลซิปารั่ม คือโปรตีนที่พบบนผิวเมอร์โรซอยต์ซึ่งมีชื่อเรียกว่าโปรตีนบนผิวเมอร์โรซอยต์ชนิดที่ 1 หรือ พีเอฟเอ็มเอสพี 1 มีขนาดน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 200 กิโลดาลตัน จากหลายการศึกษาพบว่าบริเวณด้านเอ็นเทอรมินอล และซีเทอร์มินอล ของโปรตีนประกอบด้วยอิพิโธปเป้าหมายที่สามารถกระตุ้นให้เกิดภูมิคุ้มกันต่อผู้ติดเชื้อได้ และจากการวิเคราะห์ยีนพีเอฟเอ็มเอสพี 1 ของประชากรเชื้อมาลาเรียที่พบตามธรรมชาตินั้นพบว่าบริเวณซีเทอร์มินอลมีความหลากหลายของนิวคลีโอไทด์ต่ำ ในขณะที่บริเวณเอ็นเทอรมินอลมีความหลากหลายสูงโดยสามารถจัดเป็นจีโนไทป์หลักได้ 3 จีโนไทป์ได้แก่ MAD20, K1 และ RO33 โดยกลุ่มจีนไทป์ MAD20 และ K1 นั้นประกอบด้วยส่วนของลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เรียงตัวซ้ำกันเป็นชุดที่ละ 3 กรดอะมิโน ทำให้บริเวณนี้มีความหลากหลายของลำดับเบสและจำนวนความยาวของกรดอะมิโนซ้ำกันสูง ในขณะที่จีโนไทป์ RO33 มีความหลากหลายของลำดับเบสต่ำและไม่พบลักษณะของลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เรียงตัวซ้ำกันเป็นชุด เนื่องจากภูมิคุ้มกันต่อบริเวณที่ 2 (block 2) ของโปรตีนชนิดนี้ขึ้นอยู่กับความจำเพาะของแต่ละจีโนไทป์ ดังนั้นการออกแบบวัคซีนที่มีประสิทธิภาพจึงต้องคำนึงถึงชนิดและการแพร่กระจายของจีโนไทป์ที่พบในบริเวณ block 2 ของตัวอย่างเชื้อมาลาเรียที่พบตาม
ธรรมชาติทั้งในประเด็นของสถานที่และเวลา ในการศึกษาครั้งนี้คณะผู้วิจัยจึงได้พัฒนาวิธีการที่ง่ายและสะดวก สำหรับการแยกจีโนไทป์ของเชื้อพลาสโมเดียมฟาลซิปารั่ม โดยใช้วิธีการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอของอัลลีลที่จำเพาะในบริเวณ block 2 ของยีนพีเอฟเอ็มเอสพี 1 วิธีการที่ไดัพัฒนาขึ้นมีความไวในการตรวจสอบสูง สามารถตรวจได้แม้มีปริมาณเชื้อมาลาเรียต่ำเพียง 5 ตัวต่อตัวอย่าง และสามารถตรวจแยกจีโนไทป์ที่ต่างกันได้ นอกจากนี้ยังสามารถตรวจสอบจีโนไทป์แบบผสมที่พบในตัวอย่างเดียวกันได้ และเมื่อนำวิธีการนี้มาตรวจสอบจีโนไทป์ในตัวอย่างเชื้อพลาสโมเดีนมฟาลซิปารั่มจำนวนทั้งหมด 349 ประกอบด้วย 49, 124 และ109 ตัวอย่างจากจังหวัดจันทบุรี ยะลา และตาก ตามลำดับ พบว่าสามารถตรวจพบจีโนไทป์ชนิด MAD20 จำนวน 151 ตัวอย่าง ชนิด K1 จำนวน 65 ตัวอย่าง และชนิด RO33 จำนวน 189 ตัวอย่าง นอกจากนี้ยังตรวจพบเชื้อที่มีการปะปนกันของจีโนไทปืที่แตกต่างกันใน 46 ตัวอย่าง สำหรับการแพร่กระจายของจีโนไทป์นั้นมีความแตกต่างในแต่ละพื้นที่แต่ไม่มีความต่างกันชัดเจนในช่วงฤดูกาล ผลการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนพีเอฟเอ็มเอสพี 1 จากจำนวนตัวอย่างทั้งหมด 60 ตัวอย่างที่มีรูปแบบจีโนไทป์เดี่ยวจากการตรวจสอบด้วยวิธีดังกล่าวข้างต้น พบว่าสามารถจีโนไทป์ MAD20 รูปแบบใหม่ 15 แบบ ได้แก่จีโนไทป์ M13, M14, M30, M31, M32, M33, M37, M38, M39, M40, M44, M45, M49, M53 และ M63 ซึ่งมีจำนวนชุดของกรดอะมิโนซ้ำกันอยู่ระหว่าง 5-14 ชุด โดยพบจีโนไทป์ M47 ได้บ่อยที่สุดคือพบจำนวน 16 ตัวอย่าง ในขณะที่ตรวจพบจีโนไทป์ K1 แบบใหม่ทั้งหมด 4 แบบซึ่งพบในตัวอย่างจากจังหวัดจันทบุรีทั้งหมด ได้แก่จีโนไทป์ K2, K8, K11 และ K13 โดยมีจำนวนชุดของกรดอะมิโนซ้ำกันอยู่ระหว่าง 5-12 ชุด และจีโนไทป์ K10 เป็นชนิดที่พบได้บ่อยที่สุด ส่วนผลการการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ในจีโนไทป์ RO33 จำนวน 23 ตัวอย่าง พบว่าทุกตัวอย่างเป็นจีโนไทป์แบบเดียวกันทั้งหมด และพบว่าเป็นจีโนไทป์ใหม่ที่ยังไม่มีการรายงานมาก่อนดังนั้นวิธีการตรวจสอบจีโนไทป์ด้วยวิธีพีซีอาร์ที่พัฒนาขึ้นในการศึกษาครั้งนี้จึงเป็นประโยชน์อย่างมากสำหรับการวิเคราะห์จีโนไทป์ของเชื้อพลาสโมเดียมฟาลซิปารั่มโดยใช้ยีนพีเอฟเอ็มเอสพี 1 เป็นยีนเป้าหมาย ในขณะที่การวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์นั้นให้รายละเอียดที่สำคัญการแพร่กระจายและชนิดของโคลนของเชื้อมาลาเรีย ผลของการศึกษาครั้งนี้จึงมีความสำคัญเป็นอย่างมากต่อการพัฒนาวัคซีนจากบริเวณ block 2 ของยีนพีเอฟเอ็มเอสพี 1 เพื่อป้องกันโรคมาลาเรีย
It Malaria remains the main cause of death in many tropical countries including Thailand. Efforts on malaria control focusing on humans, vectors and parasites have been hindered by the widespread occurrence of anti-malarial drug resistant parasites and insecticide resistant vectors. Therefore, development of a malaria vaccine is mandatory. One of the promising vaccine candidates for asexual blood stage vaccine of Plasmodium falciparum is protein of ~200 kDa expressed on the merozoite surface, designated merozoite surface protein 1 (PfMSP1). Several lines of evidence have indicated that the N-terminal and C-terminal parts of this part contained epitopes targeted by host protective immune responses. Analysis of PfMSP1 among natural parasite populations reveals that the C-terminal part exhibits microheterogeneity of sequences whereas the N-terminal part is characterized by 3 major allelic types with MAD20, K1 and RO33 as representative prototypes. Both the K1 type and the MAD20 type possess tripeptide repeats with sequence and size polymorphism among isolates whereas RO33 type exhibits low sequence variation with no apparent repeats. Because immunity against block 2 of PfMSP1 is allele-specific, a rational vaccine design requires knowledge on allelic distribution of PfMSP1 block 2 among natural P. falciparum populations in terms of space and time. In this study, we have developed a simple polymerase chain reaction (PCR) method for strain differentiation of P. falciparum based on the polymorphic block 2 of PfMSP1. The method was sensitive to detect as few as 5 parasites in the samples whereas specific alleles of block 2 could be unequivocally determined. Minor parasite populations in isolates containing multiple clone infections were also detected by the method. To explore the allelic distribution of block 2 of PfMSP1, 349 P. falciparum isolates from Chantaburi (n=49), Yala (n=124) and Tak (n=177) provinces were included in this analysis. MAD20, K1 and RO33 allelic types were identified in 151, 65 and 189 isolates, respectively. Multiple clone infections were observed in 46 of these isolates. The distribution of these allelic types was variable among these endemic areas whereas seasonal difference was not remarkable. Direct sequencing of 60 of these isolates that had single allelic types based on PCR has identified 15 new MAD20 sequences, designated M13, M14, M30, M31, M32, M33, M37, M38, M39, M40, M44, M45, M49, M53 and M63 that contained 5 to 14 tripeptide repeat units. The M47 type predominated among MAD20 allelic types (16 sequences). Meanwhile, 4 new K1 sequence types from Chantaburi province (K2, K8, K11 and K13) containing 5 to 12 tripeptide repeat units were detected with K10 as a predominant sequence type. On the other hand, the sequence of RO33 type was identical among 23 isolates examined in this study whose sequence was novel. Therefore, the PCR method developed in this study should be applicable for large-scale population genetic analysis of P. falciparum population based on the PfMSP-1 locus whereas direct sequencing further provides detail epidemiological evidence on parasite clone. These findings are important for PfMSP1 block 2-derived vaccine.

LOCATION	CALL#	STATUS
Medicine Library : Thesis	ว154ก 2554	CATALOGING