Title	สารออกฤทธิ์จากแบคทีเรียที่มีฤทธิ์ในการยับยั้งราก่อโรคในกล้วยไม้ Colletotrichum gloeosporioides และ Curvularia lunata / รพีวรรณ โสวรรณปรีชา = Active compound from bacterial culture fitrate with inhibitory effect against orchid-pathogeni fungi colletotrichum gloeosporioides and curvularia lunata
Author	Rapeewan Sowanpreecha
Imprint	2553
Connect to	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/36611
Descript	ก-ด, 117 แผ่น : ภาพประกอบ, แผนภูมิ

คัดเลือกแบคทีเรีย N3 จากทั้งหมด 10 ไอโซเลต เนื่องจากสามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อ Colletotrichum gloeosporioides และ Curvularia lunata ซึ่งป็นราที่ก่อโรคแอนแทรคโนส และโรคดอกสนิมหรือจุดสนิมในกล้วยไม้ได้ จากนั้นนำไปหาภาวะที่เหมาะสมเพื่อให้แบคทีเรียสร้างสารที่มีฤทธิ์ในการยับยั้งราได้ดีที่สุด โดยแปรผันชนิดของอาหารเลี้ยงเชื่อ pH และอุณหภูมิ พบว่า แบคทีเรีย N3 สร้างสารที่มีฤทธิ์ในการยับยังการเจริญของรา C. gloeosporioides และ C. lunata ได้ดีที่สุด เมื่อเลี้ยงในอาหารเหลว TSB pH 7 ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 18 ชั่วโมง และเลี้ยงแบคทีเรีย N3 ในอาหารเหลว TSB pH 6 ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 21 ชั่วโมง ตามลำดับ จากนั้นนำน้ำเลี้ยงเชื้อที่ไม่มีเซลล์แบคทีเรียไปทดสอบความเสถียรต่อ pH และอุณหภูมิ เป็นเวลา 20 นาที พบว่าสารที่มีฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญของราทั้งสองชนิดสามารถทนต่อ pH ตั้งแต่ 2-10 ได้ และทนอุณหภูมิได้ตั้งแต่ 20-121°C จากการตกตะกอนโปรตีนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตในช่วง 40-80% แล้วนำไปทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธีคอลัมน์โครมาโทกราฟีบน DEAE Bio-gel A พบว่าโปรตีนในช่วงของลำดับส่วนที่ 96-100 มีฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญของรา C. lunata ได้ เมื่อนำโปรตีนที่ได้ไปวิเคราะห์ด้วยวิธี SDS-PAGE พบว่า มีขนาด 63.3 และ 39.6 kDa ผลการทดสอบโปรตีนบริสุทธิ์ที่ได้ต่อการงอกของสปอร์ของรา C.lunata
พบว่าเส้นใยเกิดการบวมและมีการโป่งพอง เมื่อทดสอบหาความเข้มข้นที่ต่ำที่สุดของน้ำเลี้ยงเชื้อที่ไม่มีเซลล์แบคทีเรียที่สามารถยับยั้งการเจริญของรา C. gloeosporioides และ C. lunata ได้ พบว่ามีค่าเท่ากับ 15.62 และ 7.81 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ และเมื่อนำโปรตีนบริสุทธิ์ที่มีฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญของรา C.lunata มาหาความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถยับยั้งการเจริญของราได้ พบว่ามีค่าเท่ากับ 3.12 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร แบคทีเรีย N3 เป็นแบคทีเรียแกรมบวก รูปร่างเป็นท่อน สร้างสปอร์ได้ เมื่อวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์บริเวณ 16S rDNA พบว่ามีความใกล้เคียงกับ Bacillus subtilis ถึง 99% จากผลการทดลองเหล่านี้แสดงแนวโน้มว่าสามารถนำแบคทีเรีย N3 หรือสารที่มีฤทธิ์ไปประยุกต์ใช้เพื่อยับยั้งการเจริญของราที่ก่อโรคในกล้วยไม้ในสภาพแวดล้อมได้
Bacteria isolate N3 was selected from 10 bacteria isolates judging from its ability to inhibit growth of colletotrichum gloeosporioides and curvularia lunata which caused anthracnose and flower rusty spot diseases in orchid, respectively. Variation of culture media, pH, and temperature for its cultivation revealed that the optimal conditions for producing active compound against C.gloeosporioides were; culture in TSB medium at pH 7, 37°C for 18 hr, and against C.lunata were culture in TSB medium at pH 6, 37°C for 21 hr. Active compound from culture filtrate showed stability to pH in the range of 2-10 and temperature from 20-12°C for 20 minutes. Proteins were fractionated from culture filtrate with 0-40% and 40-80% saturation of ammonium sulfate were further purified by DEAE Bio-gel A anion exchange chromatography. Result indicated that active compound eluted at 0.6-0.7 M NaCl could inhibit growth of C.lunata and possessed two major bands with M.W. of 63.3 and 39.6 kDa as detected by SDS-PAGE. Purified protein caused abnormality in hyphae germination with abnormal and swollen characteristics. MIC of culture filtrate against C.gloeosporioides and C.lunata were found to be 15.62 and 7.81 μl/ml, respectively, whereas MIC of purified protein against C.lunata was 3.12 μl/ml. Taxonomic study revealed that isolate N3 is a Gram positive rod shape spore forming bacteria. 16S rDNA sequencing showed a 99% similarity to Bacillus subtilis. Results from above studies suggest potential use of B. subtilis N3 and its metabolites for inhibiting growth of orchid pathogenic fungi.

LOCATION	CALL#	STATUS
Science Library : Thesis	วพ.2553 / 5802	CHECK SHELVES
Central Library @ Chamchuri 10 : Thesis	531798	LIB USE ONLY

Chulalinet's Book Delivery Request