Title	การแสดงออกและลักษณะสมบัติของฮีมแอกกลูทินินจากไวรัสไข้หวัดนก (H5N1) ใน Pichia pastoris / รพี สินเนืองนอง = Expression and characterization of hemagglutinin from avian influenza (H5N1) virus in pichia pastoris
Author	Rapee Sinnuengnong
Imprint	2553
Connect to	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/36517
Descript	ก-ณ, 90 แผ่น : ภาพประกอบ

เชื้อไวรัสไข้หวัดนกสายพันธุ์ H5N1 เป็นเชื้อไวรัสที่ก่อให้เกิดโรคไข้หวัดใหญ่ในสัตว์ปีก ซึ่งเป็นโรคที่แพร่กระจายอย่างรวดเร็ว และเป็นสาเหตุให้เกิดความเสียหายทางด้านเศรษฐกิจและสาธารณสุข โปรตีนฮีมแอกกลูทินินเป็นโปรตีนที่มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อวงจรชีวิตของไวรัส เพราะฮีมแอกกลูทินินเป็นโปรตีนที่จะจับกับตัวรับของเซลล์เจ้าบ้าน ทำให้เข้าสู่เซลล์และเกิดการจำลองตัวเองได้ นอกจากนี้โปรตีนดังกล่าวถูกใช้ในการจัดจำแนกความรุนแรงของสายพันธุ์ของเชื้อไวรัส วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้คือ โคลน แสดงออก และศึกษาสมบัติของโปรตีนฮีมแอกกลูทินินจากไวรัสไข้หวัดนก (H5N1) ในยีสต์ Pichia pastoris ในการศึกษาครั้งนี้ได้นำยีนฮีมแอกกลูทินินจากไวรัสไข้หวัดนกจำนวน 3 สายพันธุ์ โดยเป็นสายพันธุ์ที่มีความรุนแรงในการก่อโรคสูง 2 สายพันธุ์และสายพันธุ์ที่มีความรุนแรงในการก่อโรคต่ำ 1 สายพันธุ์ มาเชื่อมเข้ากับเวกเตอร์แสดงออก pPICZαA เพื่อแสดงออกใน P. pastoris KM71 ผลการทดลองพบว่ารีคอมบิแนนท์โปรตีน HA ทั้งสาม แสดงออกภายในเซลล์ยีสต์ ขณะชักนำด้วย 4%(v/v) เมทานอล เป็นเวลา 2 วัน เมื่อวิเคราะห์ด้วย Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) และ western blotting รีคอมบิแนนท์โปรตีน HA ทั้งสาม มีขนาดประมาณ 95 กิโลดาลตัน และเกิดแถบโปรตีนขนาดเล็ก ซึ่งอาจเกิดจากการถูกย่อยด้วยเอนไซม์โปรติเอสภายในเซลล์ยีสต์ เมื่อนำรีคอมบิแนนท์โปรตีน HA ทั้งสาม ไปทำให้บริสุทธิ์ด้วยคอลัมน์ Diethylaminoethyl cellulose (DEAE column) และนำไปศึกษาสมบัติของโปรตีน พบว่ารีคอมบิแนนท์โปรตีน HA ทั้งสามที่บริสุทธิ์บางส่วน สามารถเกิดปฏิกิริยาเกาะกลุ่มกับเม็ดเลือดแดงได้ และเมื่อนำไปทำให้บริสุทธิ์ต่อด้วยคอลัมน์ Sephacryl S-200 และนำไปศึกษาสมบัติการเกิดปฏิกิริยาเกาะกลุ่มกับเม็ดเลือดแดงของโปรตีน และศึกษาการตัดด้วยเอนไซม์ Furin พบว่ารีคอมบิแนนท์โปรตีน HA ทั้งสามที่บริสุทธิ์ ไม่สามารถเกิดปฏิกิริยาเกาะกลุ่มกับเม็ดเลือดแดง และไม่สามารถถูกตัดด้วยเอนไซม์ Furin ได้
Avian influenza H5N1 virus, which causes flu in poultry, is a fast pandemic virus and causes major problems for economic and public health. Hemagglutinin (HA) is an essential protein for viral replication because it binds to a receptor on the host cell for viral entry and replication in host cell. Furthermore, hemagglutinin is used to identify the virulence strain of virus. The aim of this research was to clone, express and characterize hemagglutinin from avian flu (H5N1) virus in Pichia pastoris. In this research, the hemagglutinin gene from 3 strains of avian influenza virus, which are two strains of High Pathogenic Avian Influenza (HPAI) and one strain of Low Pathogenic Avian Influenza (LPAI), was ligated into pPICZαA expression vector for expression in P. pastoris KM71. The results showed that all three recombinant HA proteins were expressed in intracellular of yeast, while inducing with 4% (v/v) methanol for 2 days, which was analyzed by Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting. All three recombinant HA proteins were approximately 95 kDa and found as a degraded products which could result from protease activity in yeast cells. All three recombinant HA proteins were partially purified by Diethylaminoethyl cellulose (DEAE) column and were characterized. The result showed that all three partially purified recombinant HA proteins could hemagglutinate red blood cells. Moreover, all of the partially purified recombinant HA proteins were further purified with Sephacryl S-200 column. All three purified recombinant HA proteins were further characterized for hemagglutination activity and Furin cleavage assay. The results showed that all three purified recombinant HA proteins could not hemagglutinate red blood cells and could not be cleaved with Furin enzyme.

LOCATION	CALL#	STATUS
Science Library : Thesis	วพ.2553 / 5801	CHECK SHELVES
Central Library @ Chamchuri 10 : Thesis	532004	LIB USE ONLY

Chulalinet's Book Delivery Request