Title	การกลายพันธุ์ Bacillus subtilis TISTR 25 เพื่อเพิ่มการผลิตแอลคาไลน์โปรตีเอส / จันทิมา จิรนุชนาฏ = Mutagenesis of Bacillus subtilis TISTR 25 to increase alkaline protease production
Author	Jantima Jiranutchanat
Imprint	2539
Connect to	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/34726
Descript	ก-ท, 126 แผ่น : ภาพประกอบ, แผนภูมิ

งานวิจัยนี้จะเป็นการเพิ่มประสิทธิภาพการผลิตแอลคาไลน์โปรตีนเอสของ Bacillus subtilis TISTR 25 โดยการทำให้เกิดการกลายพันธุ์ด้วยแสงอัลตราไวโอเลตและสารเคมี NTG โดยทำการคัดเลือกสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ขั้นปฐมภูมิใช้โพเทนซีอินเดกช์ (Potency Index) ซึ่งตรวจดูบริเวณใสรอบ ๆ โคโลนีบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี Skim Milk และเตตร้าไซคลิน จากนั้นทำการคัดเลือกขั้นทุติยภูมิโดยวิเคราะห์แอคดิวิดีของแอลคาไลน์โปรตีนเอสในน้ำหมักโดยใช้เคซีนเป็นซับสเตรทพบว่าโพเทนซีอินเดกซ์มีความสัมพันธ์กับแอคดิวิตีแอลคาไลน์โปรตีนเอสเป็นแบบเส้นตรงฝจากการฉายแสงอัลตราไวโอเลต 20 นา ถึง 2 ครั้ง ที่ความยาวคลื่น 254 นาโนเมตร ที่ยะระห่างจากแสง 20 เซนติเมตร มีเปอร์เซ็นต์รอด 0.1 เปอร์เซ็นต์และใช้ความเข้มข้น NTG ปริมาณ 25 ปริมาณ 25 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ทำการกลายพันธุ์ 2 ครั้ง ผลการทดลองทำให้ได้สายพันธุ์ใหม่ UUNN-1 ที่สามารถผลิตแอคติวิดีของแอลคาไลน์โปรตีนเอสสูงขึ้นกว่า Bacillus subtilis TISTR 25 ถึง 81.80 เปอร์เซ็นต์ ในการทดสอบการผลิตแอลคาไลน์โปรตีนเอสในระดับขวดเขย่า พบว่าสภาวะที่เหมาะสมที่สุดในการผลิตแอลคาไลน์โปรตีนเอสของสายพันธุ์ใหม่ UUNN-1 พบว่าอยู่ที่ pH 9.5 และอุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส ซึ่งแตกต่างจาก Bacillus subtilis TISTR 25 ตรง pH ของการทำงานของแอลคาไลน์โปรตีนเอสเท่านั้น เมื่อทำการทดสอบประสิทธิภาพการผลิตแอลคาไลน์โปรตีนเอส ในถังหมักขนาด5 ลิตร ของสายพันธุ์ใหม่ UUNN-1 พบว่า สามารถผลิตแอลคาไลน์โปรตีนเอสได้สูงถึง 640.15 ยูนิตต่อมิลลิลิตร หลังการเพาะเลี้ยง 60 ชั่วโมงในอาหารที่มีวัตถุดิบผสมระหว่างกากถั่วเหลืองกับเมล็ดทานตะวัน เป็นแหล่งไนโตรเจน ซึ่งมีไนโตรเจน 0.3 กรัมเปอร์เซ็นต์ และแป้งมันสำปะหลัง 0.5 เปอร์เซ็นต์ เป็นแหล่งคาร์บอน หลังจากนั้นทำการผลิตเอนไซม์ผลแอลคาไลน์โปรตีนเอสโดยวิธีตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟต 70 เปอร์เซ็นต์และอบแห้งที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส พบว่าแอคดิวิดีจำเพาะของสายพันธุ์ใหม่ UUNN-1 เท่ากับ 709.91 ยูนิตต่อมิลลิลิตรต่อมิลลิกรัมโปรตีน และมีแอคติวิตีที่สูงกว่า Bacillus subtilis TISTR 25 ถึง 85.25 เปอร์เซ็นต์ เมื่อทดสอบแอคติวิตีของแอลคาไลน์โปรตีนเอสผงอย่างต่อเนื่องเป็นเวลา 60 วัน ที่อุณหภูมิต่ำกว่า 37 องศาเซลเซียส สามารถเก็บได้โดยไม่มีการสูญเสียแอคติวิตีเลย
The purpose of this work is to obtain alkaline protease overproducing strain Bacillus subtilis TISTR 25 by using UV light and NTG as mutagens. Potency Index was used for primary screening. The rapid primary screening for alkaline protease overproducing mutants from the parental strain on skim milk plate are typical for identification of each mutant by halo formation. After that secondary screening was done by determination of alkaline protease activity in fermentation broth by casinolysis method. This experiment showed that the correlation between potency Index and alkaline protease activity was linear. Mutagenesis was performed using the two consecutive 20 seconds irradiation time at wavelength 254 nm and a distance 20 cm from the UV lamp. The survival rate was found to be 0.1%. The two consecutive NTG concentration for the induction was 25 ug/ml. A mutant named “UUNN-l” was selected producing alkaline protease at 81.80% higher than that produced by Bacillus subtilis TISTR 25. Cultivation of UUNN-l in shaking flask, the alkaline protease activity was at pH at 9.5 and showed optimal temperature of 45 ℃ and optimal pH of 9.5 the latter differed from the enzyme produced by Bacillus subtilis TISTR 25. Cultivation in 5L fermenter containing the mixture of soy bean meal and sunflower meal and 0.3 g% as nitrogen source and 0.5% cassava starch as carbon source gave maximum alkaline protease activity of 640.15 units/ml after 60 hours. The UUNN-1 broth was precipitated with 70% ammonium sulfate and over dried at 45 ℃ . The alkaline protease powder had the specific activity of 709.91 units/mg protein, 85.25% higher than that produced by Bacillus subtilis TISTR 25. The alkaline protease powder extracted from UUNN-1 broth was stable below 37 ℃ within 60 days.

LOCATION	CALL#	STATUS
Science Library : Thesis	วพ.2539 / 2158	CHECK SHELVES

Chulalinet's Book Delivery Request