Title	เฟอริดอกชินเอนเอดีพีรีดักเตสใน chlamydomonas reinhardtii สายพันธุ์ต้านพาราควอท / สุคันธรส ธาดากิตติสาร = Ferredoxin-nadp reductase in paraquat resistant chlamydomonas reinhardtil
Author	Sukantaros Tadakittisarn
Imprint	2535
Connect to	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/48110
Descript	[16], 126 แผ่น : ภาพประกอบ, แผนภูมิ

ในงานวิจัยนี้ได้ทำให้เอนไซม์เฟอริดอกชินเอนเอดีพีรีดักเตส (FNR) จากสาหร่ายสีเขียวเซลล์เดียว Chlamydomonas reinhardtii สายพันธุ์ดั้งเดิม (137c) กับสายพันธุ์ต้านพาราควอท (PP Q-10/3) บริสุทธิ์เพื่อศึกษาเปรียบเทียบคุณสมบัติของเอนไซม์ในการอธิบายกลไกการต้านพาราควอทของพืช ผลการทดลองพบว่า ลักษณะการสังเคราะห์เอนไชม FNR ของสาหร่าย 2 สายพันธุ์ มีความสัมพันธ์ควบคู่กับการเจริญซึ่งเชลล์จะเจริญสูงสุดมีปริมาณ 5x106 และ 2.4x106 เชลล์/มล.อาหารเพาะเลี้ยงในสายพันธุ์ดั้งเดิมสายพันธุ์ PPQ-10/3 ตามลำดับ สายพันธ์ PPQ-10/3 มีการเจริญเข้าสู่ระยะสูงสุดช้ากว่าสายพันธุ์ 137c ประมาณ 2 วัน เชลล์จะสังเคราะห์ FNR สูงสุดที่ระยะปลายของการเจริญแบบทวิคูณ มีแอดคติวิดีสูงสุดประมาณ 0.021 และ 0.031 หน่วย/107 เชลล์ในสายพันธุ์ 137c และ PPQ-10/3 ตามลำดับ รูปแบบของไอโชไชม์ FNR ที่แยกด้วยโพลีอะคริลาไมด์ เจลอิเลคโตรโฟรีชีส ไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ ในจำนวน 17 แถบของ FNR ที่ตรวจพบในสารละลายเอนไซม์ที่แยกจากเชลล์ มี 2 แถบ ที่เห็นชัด (Rf 0.20 และ 0.28) สามารถแยกเอนไซม์ FNR บริสุทธิ์สูงด้วยวิธีการตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมชัลเฟต (เข้มข้นอิ่มตัว 0.70%) แยกในคอลัมน์ ดีอีเออี ทริสชาคริล ครั้งที่ 1 คอลัมน์พี 11 ฟอสโฟเชลลูโลส คอลัมน์ ดีอีเออี ทริสชาคริล ครั้งที่ 2 และการแยกโดยวิธีโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเลคโตรโฟรีชีส ได้เอนไซม์ FNR บริสุทธิ์สูงแถบเดียว (Rf 0.28) มีค่าแอดติวิตีจำเพาะใกล้เคียงกัน คือ 1.18 และ 1.25 หน่วย/มก.โปรตีน สำหรับสายพันธุ์ 137c และ PPQ-10/3 ตามลำดับ
เมื่อนำเอนไซม์ที่แยกได้ไปศึกษาคุณสมบัติต่างๆ พบว่า พีเอชที่เหมาะสมสำหรับเร่งปฏิกิริยาไดอะโฟเรสของเอนไซม์ FNR จาก 2 สายพันธุ์ มีแอคติวิตีสูงสุดที่ ช่วงพีเอช 8.5-9.0 มีอุณหภูมิเหมาะสมในการเกิดปฏิกิริยาใกล้เคียงกันอยู่ระหว่าง 65-70˚ช ปริมาณโซเดียมคลอไรด์ที่ความเข้มข้น 60 mM มีผลในการกระตุ้นปฏิกิริยาไดอะโฟเรสในสารละลายเอนไซม์เริ่มต้น แต่จะไม่มีผลในเอนไซม์บริสุทธิ์สูง จากการศึกษาค่าคงที่ทางจลศาสตร์ในเอนไซม์บริสุทธิ์สูงและเอนไซม์ที่แยกจากคอลัมน์ ดีอีเออี ทริสชาคริล ครั้งที่ 2 มีค่าใกล้เคียงกันมาก คือค่า Km ต่อสับสเตรต NADPH มีค่า 12.5±0.78 μM และ 13.3±0.89 μM ในสายพันธุ์ 137c และ PPQ-10/3 ตามลำดับ การวิเคราะห์น้ำหนักโมเลกุลโดยวิธีเอส ดีเอส โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเลคโตรโฟรีชีส ซึ่งได้แถบโปรตีนแถบเดียวมีค่าประมาณ 33,000 ดาลตัน ทั้งสองสายพันธ์ ข้อมูลจากผลการทดลองทั้งในแง่คุณภาพและปริมาณของเอนไซม์ FNR พอสรุปได้ว่ากลไกการต้านพาราควอทใน C. reinhardtii สายพันธุ์ PPQ-10/3 ไม่ได้มีการทำงานผ่านการทำงานของเอนไซม์ FNR ในระบบการทำงานของ PS I
Ferredoxin-NADP reductase was characterized and purified from the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii wild type strain (137c) and paraquat resistant (PPQ-10/3) strains. The pattern of FNR synthesis was growth associative. The maximum growth of alga cells were established at 5x106 and 2.4x106 cells/ml medium in 137c and PPQ-10/3 respectively, whereas the growth rate of PPQ-10/3 cell line was slower than the wild type. At the late log phase the maximum yield of FNR activity was observed to be about 0.021 and 0.031 units/107 cells in 137c and PPQ-10/3 respectively. The isozyme patterns of the crude enzyme in the two cell lines were not significantly different. Among 17 bands of FNR isozymes observed there were 2 major bands (Rf 0.20 and 0.28) illustrated by the polyacrylamide gel electrophoresis. The highly purified (Rf 0.28 band) was obtained by (NH4)2So4 fractionation (0.70 % saturation), 1st DEAE-trisacryl, P 11 phosphocellulose, 2nd DEAE-trisacryl column chromatography and the non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. The specific activity of FNR purified from the 2 cell lines was not significantly different (1.18 units/mg protein in 137c and 1.25 unit/mg protein for PPQ-10/3 strain). The pH optimum of the two cell lines was in the same range at 8.5-9.0 and also the optimum temperature was about 65-70℃ in both cell lines. The low concentration of NaC1 (60mM) stimulated the FNR-mediated diaphorase activity in the crude enzyme but not in the highly purified enzyme and of the enzyme obtained from the 2nd DEAE-trisacryl column were almost the same about 12.5±0.78 μM and 13.3±0.89 μM in 137c and PPQ-10/3 strain respectively. The molecular mass calculated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis in both strains were estimated to be about 33,000 dalton. The result suggested that the properties of FNR from the 137c and PPQ-10/3 were quite similar there was not significantly change in the major properties of enzyme both qualitative and quantitative through the function. It was concluded that the mechanism of paraquat resistant was not directly mediated by this redox enzyme in PS I system.

LOCATION	CALL#	STATUS
Science Library : Thesis	วพ.2535 / 1167	CHECK SHELVES

Chulalinet's Book Delivery Request