Office of Academic Resources
Chulalongkorn University
Chulalongkorn University

Home / Help

Titleการวิเคราะห์ลำดับเบสของยีนแอนไซโลสโตมาซีครีตโปรตีนชนิดที่ 2 ของพยาธิปากขอชนิดนีเคเตอร์อเมริกานัสในประเทศไทย / เจริญชัย อึ๊งเจริญสุข = Sequence analysis of the ancylostoma secreted protein-2 gene of necator americanus in Thailand
Author Jaroenchai Ungcharoensuk
Imprint 2554
Connect tohttp://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/23127
Descript ก-ฎ, 101 แผ่น : ภาพประกอบ

SUMMARY

ในปัจจุบันมีผู้ป่วยที่ได้รับเชื้อและเป็นโรคพยาธิปากขอสูงถึง 600 ถึง 700 ล้านคนทั่วโลก สามารถคำนวณเป็นจำนวนปีที่สูญเสียไปอันเนื่องมาจากการตายก่อนวัยอันควร หรือจำนวนปีที่สูญเสียไปจากภาวะทุพลภาพหรือเสื่อมสมรรถภาพ (DALY) ประมาณ 1.83 ล้าน DALY ต่อปี พยาธิปากขอชนิด Necator americanus มีอัตราชุกและการแพร่กระจายมากกว่า 85% ของการติดเชื้อพยาธิปากขอทั่วโลก โดยการสูญเสียเลือดในลำไส้จากการติดเชื้อพยาธิปากขอ นำมาสู่การเกิดโรคโลหิตจางและภาวะทุพลโภชนาการโดยเฉพาะในเด็ก ซึ่งมีผลต่อการเจริญเติบโตและพัฒนาการด้านสติปัญญา ยาฆ่าพยาธิปากขอเป็นวิธีที่ได้ถูกนำมาใช้ในการรักษาโรคพยาธิเป็นส่วนใหญ่ อย่างไรก็ตามถึงแม้ยาฆ่าพยาธิจะมีประสิทธิภาพในการกำจัดพยาธิ แต่กลับพบการติดเชื้อพยาธิปากขอซ้ำในอัตราสูงหลังจากการรักษาภายในช่วงเวลาไม่กี่เดือน ด้วยสาเหตุนี้ทำให้มีการแสวงหามาตรการอื่นเพื่อป้องกันโรคพยาธิปากขอ รวมทั้งการผลิตวัคซีน โปรตีน Ancylostoma secreted protein-2 (ASP-2) ของเชื้อพยาธิปากขอชนิด N. americanus มีศักยภาพในการเป็นองค์ประกอบของวัคซีนสำหรับป้องกันโรคพยาธิปากขอ โดยมีข้อมูลยืนยันประสิทธิภาพของโปรตีน ASP-2 จากพยาธิปากขอ ซึ่งได้มีการศึกษาทดลองในสัตว์พบว่า สามารถลดจำนวนตัวอ่อนพยาธิปากขอที่เจริญเติบโตเป็นระยะตัวเต็มวัยได้ ส่งผลให้จำนวนไข่ที่ปนออกมากับอุจจาระลดลงรวมทั้งลดการสูญเสียเลือดในลำไส้ โปรตีน ASP-2 จากพยาธิปากขอชนิด N. americanus ซึ่งมีน้ำหนักโมเลกุล 21.3 กิโลดาลตัน เรียกว่า Na-ASP-2 จากการศึกษาพบว่ายีน Na-ASP-2 มีกรดอะมิโนทั้งหมด 210 ตัวซึ่งอ้างมาจาก clone cDNA โดยความหลากหลายของยีน Na-ASP-2 ในระดับนิวคลีโอไทด์ ยังไม่มีการสำรวจจากประชากรพยาธิปากขอตามธรรมชาติมาก่อน ซึ่งถ้าโปรตีนที่เป็นองค์ประกอบของวัคซีนมี epitope ที่แตกต่างไปจากโปรตีนของพยาธิปากขอในประชากรที่ติดเชื้อโดยทั่วไป อาจทำให้วัคซีนมีประสิทธิภาพลดลงซึ่งเป็นอุปสรรคในการพัฒนาวัคซีนป้องกันโรคพยาธิปากขอ
ดังนั้นจึงได้ศึกษาโดยใช้ตัวอย่างพยาธิปากขอระยะตัวอ่อนชนิด N. americanus ทั้งหมด 32 ตัวอย่าง (ผู้ที่ติดเชื้อ 1 คนต่อตัวอ่อนพยาธิ 1 ตัว) จากผู้ป่วยที่มีเชื้อพยาธิปากขอจากจังหวัดตาก ราชบุรีและนครศรีธรรมราช แต่ละตัวอย่างได้มาจากการเพาะเลี้ยงให้เป็นระยะตัวอ่อนเพื่อเตรียมสกัดดีเอ็นเอ และเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอของยีน Na-ASP-2 ในแต่ละตัวอย่างโดยอาศัยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอร์เรส (PCR) ใช้ Primers ที่ออกแบบมาจากลำดับนิวคลีโอไทด์ของ cDNA ในฐานข้อมูล GenBank Database ของยีน Na-ASP-2 คือ accession number AY288089 จากการวิเคราะห์ผลทาง PCR พบว่าในแต่ละตัวอย่างมีขนาดประมาณ 2kb หรือ 2,000 bp ซึ่งมีขนาดยาวกว่า cDNA และในส่วนที่เพิ่มขึ้นมานั้นอาจเป็นส่วนของ intron โดยเมื่อเปรียบเทียบลำดับนิวคลีโอไทด์ของ cDNA ใน GenBank Database กับ ลำดับนิวคลีโอไทด์ของ cDNA และ genomic DNA จากที่ได้ศึกษาพบว่ายีน Na-ASP-2 ประกอบด้วย exon 8 ส่วน และ intron 7 ส่วน โดยในบริเวณระหว่างรอยต่อ exon และ intron ได้เป็นไปตาม GT/AG rule ซึ่งในส่วน intron พบได้ในยีนจำพวกเซลล์แบบยูคารีโอต และจากการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน Na-ASP-2 จำนวน 32 ตัวอย่าง พบความหลากหลายในส่วน intron 4 ส่วนจากทั้งหมด 7 ส่วน และในส่วน exon พบการแทนที่ของนิวคลีโอไทด์เพียง 3 ตำแหน่ง ซึ่งอยู่ใน 3 ส่วนจากทั้งหมด 8 ส่วน โดยมีเพียง 1 ตำแหน่งเท่านั้นที่ทำให้กรดอะมิโนเปลี่ยนชนิด ส่วน 2 ตำแหน่งไม่ทำให้กรดอะมิโนเปลี่ยนชนิด ดังนั้นจะเห็นได้ว่าลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน Na-ASP-2 ที่ได้มาจากตัวอย่างพยาธิปากขอระยะตัวอ่อนของคนมีหลากหลายอยู่ในระดับต่ำ จากข้อมูลนี้จึงน่าจะเป็นข้อสนับสนุนในการนำไปเป็นข้อมูลพื้นฐาน ของการพัฒนาวัคซีนป้องกันโรคพยาธิปากขอต่อไปได้
It has been estimated that 600 million to 700 million people are infected with hookworms, resulting in about 1.83 million disability adjusted life years (DALY). Although there are two major anthropophilic hookworm species, Necator americanus is the most prevalent and widely distributed accounting for more than 85% of total infections worldwide. Intestinal blood loss is the main pathological consequences caused by hookworm infections, leading to iron deficiency anemia and protein malnutrition. Importantly, chronic hookworm infections in children can impair neurological and cognitive functions, precluding educational achievement. Despite the availability of various strategies to control hookworms, such as administration of anthelminthic drugs and improved sanitation in endemic communities, development of vaccines against hookworms will substantially enhance other control measures. One of the attractive candidates for a hookworm vaccine is a protein expressed at the larval stage, designated Ancylostoma secreted protein-2 (ASP-2). Experimental studies in dogs and hamsters reveal that ASP-2-derived immunogens could induce specific antibodies that reduce adult worm burdens, fecal egg counts and host blood loss upon challenge infections with infective larvae. Furthermore, anti-ASP-2 antibodies could elicit inhibitory effects on larval migration through tissue. The ASP-2 homoloque has been identified in N. americanus designated Na-ASP-2, a 21.3 kDa secreted protein. Previous studies have shown that Na-ASP-2 possesses 210 amino acids as inferred from the cDNA clone. However, the extent of antigenic polymorphism in Na-ASP-2 has not been explored among natural parasite isolates, an issue that could compromise vaccine efficacy if strain-specific immunity ensues. Herein, 32 stool samples containing hookworm ova from asymptomatic individuals living in Tak, Nakorn Srithammarat and Ratchaburi Provinces were recruited for analysis. Each stool sample was subject to polythelene tube culture to generate rhabditod larvae for subsequent DNA extraction. The Na-ASP-2 gene from each isolate was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using primers derived from the 5’ and 3’ ends of the Na-ASP-2 cDNA sequence available in the GenBank database (accession number AY288089). Results showed that the PCR amplified products of each isolate measure 2 kb that was 2000 bp longer than the cDNA sequence, indicating that the Na-ASP-2 gene possesses introns. Comparing with cDNA sequence in the Ganbank database and 1 newly determined cDNA sequences in this study, 7 introns and 8 exons were identified in the Na-ASP-2 locus. Sequence analysis has revealed a consensus GT and AG at the 5’ and the 3’ boundary of each intron akin to those found in other eukaryotic genes. Of 32 sequences analyzed, size variation was observed in 4 of 7 introns whereas 3 single nucleotide polymorphism occurred in 3 exons of the gene, 2 of which were synonymous substitutions and one was nonsynonymous substitutions. Therefore, sequence conservation in the Na-ASP-2 gene indicates the lack of antigenic polymorphism in this protein among natural human isolates and encourages vaccine incorporation.


พยาธิปากขอ โรคพยาธิปากขอ แอนไซโลสโตมา Necator americanus Hookworm disease Ancylostoma

LOCATIONCALL#STATUS
Medicine Library : Thesisจ731ก 2554CATALOGING



Location



Office of Academic Resources, Chulalongkorn University, Phayathai Rd. Pathumwan Bangkok 10330 Thailand

Contact Us

Tel. 0-2218-2929,
0-2218-2927 (Library Service)
0-2218-2903 (Administrative Division)
Fax. 0-2215-3617, 0-2218-2907

Social Network

  line

facebook   instragram